細(xì)胞轉(zhuǎn)染之PEI轉(zhuǎn)染法

實(shí)驗(yàn)專欄---PEI 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

      陽離子聚合物 - 聚乙烯亞胺（PEI）是目前報(bào)道的工業(yè)化、大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)重組蛋白領(lǐng)域使用的基因載體和轉(zhuǎn)染試劑。人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）細(xì)胞是目前工業(yè)大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染領(lǐng)域使用的宿主細(xì)胞。PEI 是基因載體中的陽離子聚合物之 一，因?yàn)槠渚哂懈叩霓D(zhuǎn)染效率，所以作為基因轉(zhuǎn)染的黃金標(biāo)準(zhǔn)而常被用來參照。 PEI 形成復(fù)合物的分子量通常在 5 ～ 25 kDa之間。高分子量 PEI 一般比低分子量 PEI 有 更高轉(zhuǎn)染效率，但問題在于，高分子量的 PEI 往往有 較高的細(xì)胞毒性， 這一規(guī)律與其他聚陽離子類似。目前主要有三種主流方法：生物轉(zhuǎn)染，物理轉(zhuǎn)染和化學(xué)轉(zhuǎn)染。化學(xué)轉(zhuǎn)染方法是生物醫(yī)學(xué)研究中轉(zhuǎn)染方法，主要包括兩類：陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物。其基本原理是利用陽離子的化學(xué)分子與帶有負(fù)電荷的核酸通過正負(fù)電荷作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

PEI轉(zhuǎn)染機(jī)制

目前使用的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是 PEI。PEI 制備簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，有線狀和枝狀兩種商業(yè)試劑可選，是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染放大轉(zhuǎn)染試劑的*，是非常有潛力的非病毒質(zhì)粒載體試劑。
由于PEI 帶正電荷，與帶負(fù)電荷的DNA 結(jié)合形成帶正電荷的 PEI-DNA 復(fù)合物，可以與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面結(jié)合。PEI-DNA 復(fù)合物通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部形成內(nèi)涵體，之后一部分從內(nèi)涵體中逃逸進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，未逃逸的進(jìn)入溶酶體被降解，無法入核的 DNA 會(huì)在 100 min 內(nèi)被胞漿中的 DNA 酶降解。

PEI轉(zhuǎn)染過程

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

２９３Ｔ 細(xì)胞培養(yǎng)于 ＤＭＥＭ［含 １０％胎牛血清（ＦＢＳ）中］，置于 ３７ ℃、５％ＣＯ２ 條件下連續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24ｈ 將細(xì)胞接種于６孔板中，每孔 ５×１０５ 個(gè)細(xì)胞且均勻分布，用于轉(zhuǎn)染.

2.２９３Ｔ 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取 ６ 孔板細(xì)胞，ＰＢＳ 緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合和 ＰＥＩ 轉(zhuǎn)染混合液，對(duì)照組加 入 等 量 無 血 清 ＤＭＥＭ，邊 加 邊 混 勻，３７ ℃，５％ＣＯ２ 培養(yǎng) ６ ｈ。轉(zhuǎn)染后去除轉(zhuǎn)染混合液，每孔加入*培養(yǎng)基２ ｍＬ 繼續(xù)培養(yǎng)，４８ ｈ 后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

3. 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用 ＣＣＫ-８ 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)

4. 轉(zhuǎn)染后綠色熒光觀察及監(jiān)測(cè)表達(dá)

在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48ｈ后帶有綠色熒光的細(xì)胞比例，有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染成功。

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